Recommandations : Techniques de Dosage

Recommandations 2007 : prélèvements destinés aux tests d'Hémostase

Le groupe de travail, coordonné par Catherine Boinot et composé de B. Delahousse, C. Droullé, M.F. Hurtaud, B. Polack et A. Robert, a mis à jour les données concernant les variables préanalytiques. (Les recommandations émises en 1998 par le GEHT sont téléchargeables en cliquant ici)

Choix des tubes, matériaux :
Il est recommandé d’utiliser un tube à prélèvement sous vide. Le verre siliconé et le PET « étanchéifié » sont également recommandables. Les qualités du tube doivent être documentées et reconnues par un marquage CE.

Anticoagulant :
L’anticoagulant de référence est le citrate de sodium. La concentration recommandée pour la coagulation est 0,109 mole (3,2%). Le citrate doit être tamponné pour maintenir le pH entre 5,1 et 5,3 pour garantir un pH du plasma entre 7,3 et 7,45. Le rapport anticoagulant/sang est de 1 volume d’anticoagulant pour 9 volumes de sang.

Volume d’air résiduel :
Le volume d’air résiduel, quelque soit la géométrie du tube, doit être de 20% maximum.

Hématocrite :
L’utilisation d’un tube à prélèvement sous vide rend impossible la modification du volume d’anticoagulant en fonction de l’hématocrite. Des réserves doivent être émises pour les résultats si l’hématocrite est > 55% ou < 30%.

Anticoagulant spécialisé :
Le mélange CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est sensible aux photons. Il convient de le stocker à l’abri de la lumière et de s’assurer auprès du fabricant que la concentration nominale des composants sensibles à la lumière soit préservée après stérilisation. Ce tube est utile pour le dosage des héparines non fractionnées et l’étude des glycoprotéines de membranes plaquettaires en cytométrie en flux. Ce tube ne permet pas l’étude des fonctions plaquettaires.

Prélèvement :

1 - Conditions optimales :
- le matin, au repos depuis plus de 5 minutes, en position assise
- un repas léger sans matières grasses est autorisé
- tabac, exercice physique, caféine sont à éviter

2 - Taille optimale de l’aiguille :
Diamètre compris entre 19 G (1mm) et 22 G (0.7mm). Prélèvements pédiatriques : aiguilles de diamètre 23 G acceptables.
Les aiguilles à ailettes de type « épicrânienne » peuvent être utilisées si la tubulure est courte (longueur < 6cm et volume mort < 150 µl). Elles sont recommandées chez l’enfant et chez l’adulte en présence de veines fines ou difficiles. Les systèmes de raccordement, type Luer®, sont à éviter en cas d’études spécialisées de l’hémostase.

3 - Garrot :
Peu serré, maintenu moins d’1 minute. Si les veines sont fines ou difficiles, le laisser en place en le serrant modérément. Avec les tubes sous vide, dès que le sang afflue dans le tube, le garrot doit être desserré.

4 - Site de ponction :
Eloigné de toute perfusion

5 - Ordre de prélèvement des tubes :

1 - Tube sec sans activateur ou tube de « purge », si utilisation de systèmes de prélèvement avec tubulure dont le volume d’air est supérieur à 300µl
2 - Tube citraté

3 - Les autres tubes (EDTA, héparine…)
En cas de bilan comportant un examen unique d’hémostase, le premier tube peut être conservé, si la ponction veineuse est franche et si le bilan ne comporte que des tests courants de coagulation. Cette recommandation s’applique particulièrement pour la surveillance des traitements par antivitamines K.

6 - Remplissage des tubes :
>90% recommandé, 80% acceptable

7 - Conditions de transport et de conservation :
Dans les véhicules de transport, les échantillons doivent être en position verticale. La température de transport et de conservation des échantillons avant la réalisation des tests doit être comprise entre 18°C et 22°C. Une température de +2°C à + 4°C est fortement déconseillée.

8 - Délai entre le prélèvement et la réalisation des tests
Le délai est idéalement de 1 à 2 heures et ne doit pas dépasser 4 heures (6 heures à température ambiante est cependant acceptable pour le TQuick). Si ceci ne peut pas être respecté, la centrifugation des prélèvements doit être effectuée et le plasma décanté et congelé.

9 - Centrifugation (préparation d'un plasma pauvre en plaquettes (PPP)) :

Vitesse et durée :
- pour tests de routine sur plasma frais : 2000-2500 g pendant 15 minutes.
- pour la détection d’anticoagulant lupique, le test de résistance à la protéine C activée par la technique technique d'origine sur plasma frais, et pour tout plasma devant être congelé :
double centrifugation de chacune 15 minutes à 2500 g, avec décantation du plasma entre les deux opérations (obtention d’un nombre de plaquettes résiduelles < 10 x 109/l)
Validation des performances de centrifugation tous les 6 mois.

Température :
Pour la plupart des tests, température ambiante (18-22°C) dans centrifugeuse thermostatée.

10 - Congélation
Aliquots de petit volume (500 à 1200 microlitres), tubes avec bouchons à vis, en matériau non mouillable et capacité adaptée à l’échantillon (volume d’air le plus faible possible). La plus rapide possible : azote liquide, sinon à -70°C plutôt qu’à -20°C. Conservation des échantillons congelés : 2 semaines à -20°C et jusqu’à 6 mois à -70°C.

11 - Décongélation
Rapide au bain-marie à 37°C, puis homogénéisation et test immédiat. Si tests différés : conservation à + 4°C < 2 heures. Recongélation : à proscrire pour tous les tests fonctionnels.